Bagaimana Cara Memotong DNA?

Dalam ilmu biologi melekular, aktivitas memotong DNA adalah salah satu kegiatan yang sering dilakukan. Pemotongan DNA dapat menggunakan enzim endonuklease yang sering dilakukan dalam teknik biologi molekuler dengan menggunakan DNA sebagai bahan kajian. 

Enzim endonuklease yang memutus ikatan fosfodiester pada DNA dikelompokakan kedalam nuklease. Enzim nuklease dibagi menjadi dua yakni eksonuklease yang memutus ikatan fosfodiester mulai dari ujung rantai DNA dan endonuklease yang memutus ikatan fosfodiester pada bagian dalam rantai DNA.

Enzim endonuklease restriksi mengkatalisis pemotongan DNA pada bagian dalam rantai DNA yang ditandai dengan adanya urutan nukleotida (4-6 bp) yang khas.

Urutan nukleotida yang dikenali oleh enzim tersebut sering disebut sebagai urutan palindromic, yakni urutan yang apabila dibaca dari kiri ke kanan sama dengan urutan kalau dibaca dari kanan ke kiri, misalnya 5’AATT  3’ dan  3’TTAA 5’.

Ada berbagai jenis endonuklease restriksi yang berhasil diisolasi dan dapat dibeli secara komersial, antara lain: EcoR I, Hind III, BamH 1, Sal 1 dan lain-lain yang sudah pernah diulas di tulisan sebelumnya: Enzim Restriksi. Enzim tersebut umumnya bekerja optimal pada suhu 37°C dan dalam buffer dengan pH optimum. 

Gambar 1. Sekuens Palindromik.

DNA yang akan diputus ikatan fosfodiesternya oleh enzim tersebut harus memiliki urutan yang khas yang dikenali oleh enzim yang digunakan. Untuk mengetahui enzim tersebut  bekerja secara baik, maka diperlukan sampel kontrol positif (DNA yang jelas mengandung daerah restriksi untuk enzim yang digunakan) dan kontrol negatif (DNA yang tidak diberi enzim yang akan diuji dengan sampel kita).

Apabila yang digunakan sebagai sampel DNA adalah DNA genom maka pemberian endonuklease restriksi akan menyebabkan fragmen DNA yang ukurannya bervariasi. Jika yang digunakan DNA plasmid (ukurannya jauh lebih kecil) yang memiliki daerah yang mampu dikenali endonuklease restriksi maka akan didapatkan sejumlah fragmen DNA tergantung dari banyaknya daerah restriksi pada DNA plasmid tersebut.

Sebagai contoh DNA yang dipotong adalah DNA plasmid (pGAS102) dan tumbuhan. Enzim yang mampu memotong untaian DNA pGAS102 dan DNA tumbuhan adalah enzim nuklease. Atau disebut deoksiribonuklease atau Dnase (Howe, 2007). Salah satu enzim yang dipakai untuk memotong DNA tersebut adalah enzim restriksi nuklease. Enzim ini mampu memotong DNA pada urutan yang spesifik. Dalam kegiatan praktikum ini digunakan enzim restriksi endonuklease berupa BamHI yang merupakan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi tipe II hanya memiliki aktivitas restriksi dengan kofaktor berupa Mg2+, sementara aktivitas metilasi dilakukan oleh enzim metilase (Reece, 2004).

Enzim BamHI ini memiliki kofaktor berupa ion Mg2+, sehingga dalam prosedur praktikum restriksi plasmid diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi (Ausubel, 2003; Reece, 2004). Adapun kinerja enzim BamHI tersebut mampu memotong ikatan fosfodiester pada urutan DNA pada sisi:

5′ G↓G-A-T-C-C 3′

3′ C-C-T-A-G↑G 5′

Enzim restriksi tersebut mampu mengenali urutan nukleotida yang sama (G-G), sehingga BamHI disebut juga sebagai isoschizomer. Hasil potongan oleh enzim BamHI berupa formasi 5′–PO4– dan 3′–OH yang bagian terminalnya berbentuk asimetris atau sticky ends. (Ausubel, 2003; Becker et al., 1996).  

Enzim BamHI bekerja dengan cara melakukan scanning sekuens non-spesifik di sepanjang DNA dengan cara meluncur (sliding), setelah itu ketika enzim tersebut menemukan sekuens spesifik berupa 5′ G-G-A-T-C-C 3′ maka akan berupa konformasinyan dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester antara nukleotida G menjadi fragmen yang terpisah (Allison, 2007).

Pada tahap pemotongan plasmid pGAS102 dan genom tumbuhan, selain diberi enzim restriksi BamHI juga diberi buffer yang terdiri dari 500mM Tris-HCl pH 7.5, 100mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol (DTT), dan 100mM NaCl. Buffer Tris-HCl digunakan untuk mempertahankan keoptimalan pH enzim. Hal ini dikarenakan Tris-HCl merupakan buffer dengan rentang pH 7-9 yang secara tipikal mampu mempertahankan keadaan fisiologis seperti dalam sel (Ausubel, 2003). 

Kombinasi Tris-HCl dan NaCl akan mengaktifkan kinerja enzim  endonuklease. Selain itu, adanya MgCl2 seperti yang dijelaskan sebelumnya mampu memberikan konstribusi ion bivalen berupa Mg2+ yang bertindak sebagai kofaktor enzim BamHI yang bertujuan agar meningkatkan kinerja enzim tersebut (Ausubel, 2003; Reece, 2004). 

Adapun fungsi ¬Dithiothreitol (DTT) selain sebagai buffer, DTT juga memiliki fungsi sebagai penstabil terhadap oksidasi oleh udara atau antioksidan yang bertujuan agar DNA tidak mengalami kerusakan oksidatif selam proses restriksi (Sambrook et al., 2001; Wilson&Walker, 2010).

Penulis:
Mh Badrut Tamam, M. Sc.
email: mh.badruttamam@IndoINT.com

Sumber https://www.generasibiologi.com/

Share this post