Metode dan Teknik Isolasi Mikroba

Manusia hidup tak pernah lepas dari interaksinya dengan makhluk hidup lain, khususnya mikroorganisme. Setiap jenis mikroorganisme, baik kapang, khamir, maupun bakteri, selalu berhubungan dengan kehidupan manusia sehari-hari. Mengingat hal tersebut, diperlukan pengetahuan mengenai sifat dan jenis mikroorganisme yang ada. Untuk mempermudah dalam mempelajari sifat dan jenis suatu mikroorganisme, harus diperoleh sebuah biakan murni atau pure culture dari mikroorganisme tersebut. Biakan murni atau pure culture adalah kultur yang mengandung hanya sebuah spesies tunggal dari organisme.  Biakan murni dapat diperoleh dengan cara melakukan isolasi mikroorganisme (Black, 2008). Isolasi mikroorganisme adalah suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme dari lingkungannya sehingga diperoleh biakan yang tidak tercampur dengan jenis yang lain (Gandjar dkk., 1992).

Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikrooganisme sehingga biakan murni terbebas dari kontaminan.  Kontaminan adalah organisme yang tidak diinginkan ada bersama biakan murni (Madigan dkk., 2011. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi mikroorganisme tersebut misalnya prosedur teknik aseptik, jenis medium yang digunakan, teknik isolasi, teknik pemilihan sumber biakan (koloni), dan penyimpanan pasca isolasi mikroorganisme (Harley & Prescott, 2002; Madigan dkk., 2011).

Sementara itu, jenis medium yang cocok digunakan untuk memperoleh biakan murni adalah medium padat, khususnya medium padat dalam cawan petri. Medium padat dapat menghentikan pergerakan sel-sel, kemudian mengizinkan sel-sel mikroba untuk tumbuh dan membentuk massa yang tampak sebagai sebuah entitas tersendiri yang disebut koloni (Madigan dkk, 2011). Koloni merepresentasikan perbanyakan dari sebuah organisme tunggal (Cappucino & Sherman, 2002:).

Teknik Isolasi Mikroorganisme
Teknik isolasi untuk memperoleh biakan murni ada beberapa cara tergantung substratnya. Isolasi mikroba dari substrat cair dapat menggunakan cara sebar (spread method) dan cara tuang (pour-plate method).  Isolasi mikroba dari substrat padat dapat menggunakan cara tabur (spread method) dan cara suspensi (Gambar 1). Hal yang perlu diperhatikan pula adalah dalam memilih sumber biakan, seperti memilih koloni yang representatif untuk diambil menjadi biakan murni.  Koloni yang berada di bagian tengah dari sampel biasanya kurang terkontaminasi dibandingkan koloni yang berada di bagian pinggir (Harley & Prescott, 2002). Selain itu, koloni yang dipilih adalah yang benar-benar telah terpisah dengan koloni lain  (Madigan dkk., 2011). Setelah melakukan isolasi, diperlukan upaya untuk menjaga agar biakan tersebut tetap baik, misalnya dengan disimpan di pendingin atau alat pengering (Harley & Prescott, 2002:).

Gambar 1. Metode memperoleh biakan murni.

Biakan murni dapat berupa bakteri atau jamur. Bakteri merupakan organisme uniseluler, relatif berbentuk sederhana, tidak mempunyai membran inti (prokariot), dan komponen utama penyusun dinding selnya adalah peptidoglikan.  Sementara itu, jamur adalah organisme yang telah memiliki membran inti, merupakan organisme uniseluler atau multiseluler, dan komponen utama penyusun dinding sel umumnya adalah kitin (Tortora dkk., 2010).

Jamur dapat dibedakan menjadi bentuk khamir, kapang, dan cendawan. Jamur dalam bentuk uniseluler disebut khamir, merupakan bentuk mikroorganisme berbentuk oval dan ukurannya lebih besar dari bakteri.  Kapang merupakan bentuk jamur yang terlihat seperti serabut-serabut benang yang disebut miselia.  Miselia terdiri dari filamen-filamen (hifa) panjang yang bercabang dan saling menjalin.  Cendawan adalah jamur multiseluler besar yang bentuknya menyerupai tumbuhan (Tortora dkk., 2010).

Mikroorganisme hidup menempati habitat yang sangat beragam. Habitat atau substrat merupakan lingkungan atau tempat tinggal suatu komunitas mikroorganisme di dalam suatu ekosistem (Madigan dkk., 2011). Mikroorganisme dapat tumbuh dan bertempat tinggal bersama-sama di samudera, danau, tanah, jaringan yang hidup dan jaringan yang mati (Black, 2008). Selain itu, ada juga mikroorganisme yang dapat hidup di habitat yang ekstrem, seperti hidup di kondisi suhu dan salinitas yang sangat tinggi (Tortora dkk., 2010).  Jika dilihat dari bentuk substratnya, mikroorganisme dapat ditemukan pada substrat yang padat dan yang cair.  Untuk memudahkan dalam mempelajarinya, diperlukan suatu cara untuk memisahkan mikroorganisme dari substrat atau habitatnya yang disebut isolasi mikroorganisme. Ada beberapa metode yang dapat dipakai untuk mengisolasi mikroorganisme berdasarkan substratnya (Gandjar dkk., 1992).

Gambar 2. Isolasi mikroba dari substrat cair dengan metode suspensi.

Jika akan melakukan isolasi mikroorganisme dari substrat cair dapat dilakukan dengan metode sebar dan metode tuang (Gambar 2). Metode sebar dilakukan dengan cara mengambil sejumlah kecil cairan yang mengandung campuran mikroba dan meletakannya di medium padat, kemudian cairan diratakan pada permukaan medium dengan menggunakan spatel bentuk L atau spatel drygalski. Metode tuang dilakukan dengan cara mecairkan medium dan memasukkan beberapa ose bahan cair yang akan diperiksa ke dalam medium yang telah dicairkan tadi, kemudian medium yang sudah diinokulasi di tuang ke cawan petri yang steril dan digoyang-goyang hingga merata. Setelah terbentuk koloni, biakan murni dapat dibuat dengan cara mengambil beberapa ose dari koloni tersebut dan dipindahkan ke medium steril yang lain (Gandjar dkk., 1992; Harley & Prescott, 2002).

Metode untuk isolasi mikroorganisme dari substrat padat dapat dilakukan dengan cara tabur dan suspensi.  Metode tabur dilakukan dengan cara menaburkan serbuk padat yang akan diperiksa di atas permukaan medium dalam cawan petri, kemudian diratakan dengan menggunakan spatel drygalski. Metode suspensi dilakukan dengan cara meyuspensikan bahan padat pada akuades dan diambil beberapa ose dari suspensi tadi untuk dimasukkan ke medium yang telah dicairkan, kemudian medium dituang ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan hingga mengeras. Setelah terbentuk koloni, biakan murni dapat dibuat dengan cara mengambil beberapa ose dari koloni yang representatif dan dipindahkan ke medium steril yang lain (Gandjar dkk., 1992). 

Untuk dapat memindahkan suatu biakan atau beberapa ose koloni ke dalam medium steril yang lain, diperlukan suatu teknik transfer biakan.  Ada dua cara metode pemindahan biakan, yaitu metode zig-zag (streak) dan metode penempatan pada sebuah titik atau tanam (stab). Metode zig-zag biasa digunakan untuk memindahkan biakan khamir dan bakteri. Cara memindahkannya yaitu dengan menggoreskan ujung jarum loop yang telah mengandung khamir/bakteri secara zig-zag di atas permukaan medium miring mulai dari ujung bagian bawah sampai bagian atas. Metode stab digunakan untuk memindahkan biakan kapang.  Biakan kapang diambil sedikit dengan menggunakan jarum needle atau jarum tanam tajam, kemudian jarum diletakkan di atas permukaan medium miring kira-kira pada jarak 1/3 dari panjang permukaan medium (Gandjar dkk., 1992).

Gambar 3. Transfer biakan (a-c) metode stab; (d) metode streak.
Credit: Harley & Prescott, 2002

Teknik Kerja Aseptik
Teknik aseptik merupakan suatu prosedur yang dilakukan untuk mencegah atau mengurangi terjadinya kontaminasi (Harley & Prescott, 2002).  Salah satu teknik aseptik yang dilakukan adalah dengan melakukan pekerjaan selalu dekat dengan api. Ketika sedang melakukan pembukaan pada cawan petri atau tabung medium, diusahakan untuk selalu melewatkannya kepada  api pada bagian dari benda yang dibuka, sehingga kontaminasi mikroba dari udara dapat dihindari (Madigan dkk., 2011).

Desinfektan adalah suatu bahan kimia, biasanya berbentuk larutan, yang mempunyai sifat mampu membunuh sel vegetatif mikroorganisme, tetapi tidak membunuh endospora.  Salah satu contoh desinfektan adalah hidrogen peroksida atau H2O2.  Hidrogen peroksida adalah salah satu desinfektan yang biasa digunakan untuk mensterilkan biji-bijian. Setelah disteril dengan bahan tersebut, biji harus disteril dengan akuades steril (Gandjar dkk., 1992).

Hidrogen peroksida dapat berperan sebagai antiseptik (3% dari larutan) dan sanitizer (Madigan dkk., 2011). Hidrogen peroksida dapat berbahaya bagi mikroorganisme karena aksi langsung dan tidak langsung dari oksigen.  Oksigen membentuk hidroksil radikal bebas (.OH), mirip radikal superoksida
yang sangat toksik dan reaktif bagi sel. Meskipun kebanyakan sel mikroba dapat memproduksi enzim katalase untuk menginaktivasi metabolisme hidrogen peroksida, sel mikroba tetap tidak mampu menetralisir hidrogen peroksida yang masuk ke sel selama disinfeksi dan antisepsis dilakukan (Talaro & Talaro, 2002).

Referensi

• Benson. 2001. Microbiological application lab manual, 8th ed. 
• Black, J. G. 2008. Microbiology, 7th ed. 
• Campbell, N. A. & J. B. Reece. 2009. Biology, 8th ed. 
• Cappuccino, J. G. & N. Sherman. 2002. Microbiology: A laboratory manual. 
• Collins, C. H. and; P. M. Lyne. 2004. Collins and Lyne's microbiological methods. 
• Harley & Prescott. 2002. Laboratory exercises in microbiology, 5th ed. 
• Morello, J. A., P. A. Granato & H. E. Mizer. 2003. Laboratory manual and  workbook in microbiology: Applications to patient care. 
• Nester, E. W., D. G. Anderson, C. E. Roberts, N. N. Pearsall & M. T. Nester. 2004. Microbiology: A human perspective, 4th ed. 
• Tortora, G. J., B. R. Funke & C. L. Case. 2010. Microbiology: An introduction, 10th.
• Watt, B., J. G. Collee & R. Brown. 1976. Tests of performance of anaerobic jars.

Sumber https://www.generasibiologi.com/

Share this post