Pengertian dan Cara Kerja Elektroforesis
Thursday, August 16, 2012
Elektroforesis merupakan proses migrasi molekul bermuatan dalam medium yang dialiri arus listrik (Holme dan Hazel, 1998). Westermeier (2005) menjelaskan bahwa prinsip dasar elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan listrik. Laju migrasi molekul bermuatan tersebut menuju elektrode yang bermuatan negatif disebut elektromobilitas.
Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor, sebagaimana yang dijabarkan oleh Switzer (1999) bahwa semakin besar muatan molekul maka semakin besar pula elektromobilitasnya, nilai elektromobilitas berbanding terbalik dengan besar ukuran molekul sehingga molekul dengan ukuran lebih besar memiliki elektromobilitas yang lebih kecil bila dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebih kecil. Selain besar muatan dan ukuran molekul tersebut, topologi atau bentuk molekul turut berpengaruh pula terhadap elektromobilitas suatu molekul.
Elektroforesis DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008). Metode elektroforesis tersebut pada prinsipnya melibatkan fase stasioner yang berupa gel agarosa dan fase gerak berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Tris-borat EDTA (TBE) (Switzer, 1999). TBE (Tris-borat EDTA) 1X, Tris/Borat adalah buffer yang umum digunakan sebagai buffer elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi pada titik isoelektriknya (Ausubel, et al., 2003). Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga dapat mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektroda, hal ini berhubungan dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH saat migrasi fragmen DNA berlangsung, perubahan pH dapat mendenaturasi struktur DNA sehingga mengubah elektromobilitas DNA (Martin, 1996). Contoh alat eletroforesis berada pada Gambar 1.
Elektromobilitas suatu molekul dipengaruhi oleh beberapa faktor, sebagaimana yang dijabarkan oleh Switzer (1999) bahwa semakin besar muatan molekul maka semakin besar pula elektromobilitasnya, nilai elektromobilitas berbanding terbalik dengan besar ukuran molekul sehingga molekul dengan ukuran lebih besar memiliki elektromobilitas yang lebih kecil bila dibandingkan dengan molekul yang berukuran lebih kecil. Selain besar muatan dan ukuran molekul tersebut, topologi atau bentuk molekul turut berpengaruh pula terhadap elektromobilitas suatu molekul.
Elektroforesis DNA umumnya menggunakan metode elektroforesis gel agarosa (Karp, 2008). Metode elektroforesis tersebut pada prinsipnya melibatkan fase stasioner yang berupa gel agarosa dan fase gerak berupa buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Tris-borat EDTA (TBE) (Switzer, 1999). TBE (Tris-borat EDTA) 1X, Tris/Borat adalah buffer yang umum digunakan sebagai buffer elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi pada titik isoelektriknya (Ausubel, et al., 2003). Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga dapat mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektroda, hal ini berhubungan dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH saat migrasi fragmen DNA berlangsung, perubahan pH dapat mendenaturasi struktur DNA sehingga mengubah elektromobilitas DNA (Martin, 1996). Contoh alat eletroforesis berada pada Gambar 1.
Gambar 1. Alat elektroforesis (Ausubel et al., 2003).
Agarosa merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah (Miesfeld, 1999). Gel agarose dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp, sedangkan untuk memisahkan DNA dengan ukran lebih pendek dapat digunakan gel poliakrilamid (Wilson dan John, 1994). Gel agarose merupakan fase diam dalam pemisahan fragmen DNA, konsentrasi agarose yang digunakan dalam pemisahan fragmen DNA sangat mempengaruhi mobilitas fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang digunakan maka semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin besar pori-pori gel. Perangkat dalam elektroforesis gel agarosa diantaranya terdiri dari power supply sebagai sumber arus listrik; cetakan gel; sisir yang digunakan untuk membuat sumuran tempat peletakan DNA yang akan dielektroforesis. Pembuatan sumuran ini dilakukan dengan meletakkan sisir pada gel sebelum gel memadat; tangki elektroforesis; dan elektrode(Martin, 1996).
Pemisahan fragmen DNA berdasarkan elektromobilitas berguna sebagai metode analitik maupun preparatif, molekul DNA yang bermuatan negatif karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis (Miesfeld, 1999). Fragmen DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama pula (Gilbert, 2000). Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah diketahui ukurannya (standard) dapat berguna dalam analisis besar ukuran DNA dalam sampel (Switzer, 1999) (Gambar 2).
Maloy et al. (1994) menjelaskan bahwa topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak. DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis, loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses running elektroforesis. bromphenol blue dan xylenecyanol merupakan jenis loading dye yang umum digunakan dalam elektroforesis DNA, bromphenol blue dapat bermigrasi bersama dengan molekul DNA berukuran 0,5 kb sedangkan xylenecyanol dapat bermigrasi bersama molekul DNA berukuran 5 kb (Ausubel et al., 2003).
Pemisahan fragmen DNA berdasarkan elektromobilitas berguna sebagai metode analitik maupun preparatif, molekul DNA yang bermuatan negatif karena adanya gugus fosfat akan bergerak menuju anode (elektrode bermuatan positif) saat dipisahkan dengan elektroforesis (Miesfeld, 1999). Fragmen DNA yang memiliki ukuran molekul yang sama akan memiliki elektromobilitas yang sama dan menempuh jarak migrasi yang sama pula (Gilbert, 2000). Proses running elektroforesis DNA sampel bersamaan dengan DNA yang telah diketahui ukurannya (standard) dapat berguna dalam analisis besar ukuran DNA dalam sampel (Switzer, 1999) (Gambar 2).
Maloy et al. (1994) menjelaskan bahwa topologi DNA yang dipisahkan menentukan elektromobilitas DNA. DNA yang mengalami supercoil akan bermigrasi lebih cepat karena strukturnya sangat kompak. DNA yang akan dielektroforesis pada umumnya dicampur dengan loading dye yang berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis, loading dye bermigrasi bersama molekul DNA selama proses running elektroforesis. bromphenol blue dan xylenecyanol merupakan jenis loading dye yang umum digunakan dalam elektroforesis DNA, bromphenol blue dapat bermigrasi bersama dengan molekul DNA berukuran 0,5 kb sedangkan xylenecyanol dapat bermigrasi bersama molekul DNA berukuran 5 kb (Ausubel et al., 2003).
Gambar 2. Mobilitas molekul DNA dalam agar pada saat running.
Hasil elektroforesis dapat divisualisasi dengan menggunakan pewarna fluoresensi ethidium bromide (EtBr) (Gilbert, 2000). Secara teknis, setelah proses running, gel direndam dalam larutan buffer TBE atau TAE yang mengandung ethidium bromide, selanjutnya ethidium bromide akan berdifusi ke dalam gel dan berasosiasi dengan DNA (Switzer, 1999). Ethidium bromide mampu berinterkalasi diantara pasang basa nukleotida pada struktur double heliks (Gambar 3) dan saat gel hasil elektroforesis disinari dengan ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah tampak sebagai band-band berwarna oranye (Campbell dan Shawn, 2009).
Gambar 3. Interkalasi ethidium bromide dalam molekul DNA.
Referensi:
- Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology.
- Campbell, M. K. and Shawn F. 2009. Biochemistry.
- Clark, Melody S. 1997. Plant molecular biology: A laboratory manual. Berlin
- Davis, L., Michael K., and James B. 1994. Basic methods in molecular biology.
- Holme, D. J. and Hazel P. 1998. Analytical biochemistry. England.
- Gilbert, H. F. 2000. Basic concepts in biochemistry.
- Maloy, S. R., John E. C. Jr., and David F. 1994. Microbial genetics.
- McPherson, Michael J. and Simon G. Møller. 2006. PCR, 2nd ed.
- Karp, Gerald. 2008. Cell and molecular biology.
- Kirby, Lorne T. 1992. DNA Fingerprinting.
- Lehninger, A.L. et al. Cox, 2000. Principles of Biochemistry, 3rd ed.
- Martin, Robin. 1996. Gel electrophoresis: Nucleic acids.
- Miesfeld, Roger L. 1999. Applied Molecular Genetics.
- Switzer. 1999. Experimental Biochemistry.
- Pierce, Benjamin A. 2002. Genetics.
- Westermeier, Reiner. 2005. Electrophoresis in Practice.
- Wilson, K. and John M. W. 1994. Principles and Techniques of Practical Biochemistry.
- Zyskind, J. W. and Sanford I. B. 1992. Recombinant DNA Laboratory Manual.